Die RNA Interferenz hat sich zu einem wichtigen Werkzeug für sogenannte Loss-of-Function Studien entwickelt und maßgeblich den Einsatz von Screens mit hohem Durchsatz gefördert. Zahlreiche Studien trugen dazu bei, neue genetische Funktionen in vielen biologischen Prozessen zu identifizieren. Die meisten dieser Studien nutzten dabei eine Endpunkt-Analyse zur Bestimmung des jeweiligen Phänotyps.
In einer kürzlich durchgeführten Studie, analysierten Ulrich Tschulena et al vom Deutschen Krebsforschungszentrum, Abteilung Molekulare Genomanalyse, in Heidelberg die Auswirkungen des geringeren Levels von 160 humanen Kinasen auf das Zellwachstum in Echtzeit zu untersuchen. Die Wissenschaftler führten einen genetischen Loss-of-Function Screen mit einer Small Interfering RNA (siRNA) Library bestehend aus 160 Kinasen durch.
Um die Kinasen zu identifizieren, die einen Einfluss auf das Zellwachstum haben, untersuchten die Forscher eine siRNA Library, die aus Pools von vier siRNAs pro Gen der 160 getesteten humanen Kinasen mit einer Konzentration von 60nM bestehen. Bei der Analyse der Proben, die mit der siRNA Library transfiziert waren, zeigten 36 der insgesamt 160 siRNAs keinen signifikanten Effekte im Vergleich zu Placeboproben oder Negativkontrollen, die nicht mit siRNAs transfiziert wurden. Jedoch führte der Knock-down mehrerer Gene zu beträchtlichen Veränderungen in der Wachstumskurve. Wie erwartet, löste der Knockdown von mehr als der Hälfte der 160 getesteten Kinasen einen inhibitorischen Effekt auf das Zellwachstum aus. Im Gegensatz dazu erzeugt z.B. die siRNA EphA4 eine Zunahme des elektrischen Zellwiderstands im Vergleich zu den Negativkontrollen, die nicht mit siRNAs transfiziert wurden. Dies lässt auf einen Aktivierungseffekt bei der Zellproliferation schließen wenn die EphA4 Kinase nicht mehr vorhanden ist.
Die Experimente zeigen, dass das xCELLigence System eine einfache Methode ist, die Auswirkungen von Gen Knock-downs in Echtzeit zu analysieren: Das System bietet kontinuierlich eine große Menge an Informationen über den elektrischen Widerstand am Boden der Wells der Mikrotiterplatten. Zudem kann jede Veränderung hinsichtlich Zellanzahl, Zellmorphologie und Zellanhang in Echtzeit entdeckt werden. Das xCELLigence System kann gut kombiniert werden mit reverse-genetischen Screening-Experimenten die ein automatisiertes System wie die Biomek FXP Liquid Handling Workstation verwenden. Die Ergebnisse zeigen eine hohe Reproduzierbarkeit des Systems mit einem Variationskoeffizienten von unter 0,05. Darüber hinaus ist das System sehr nützlich in der Überwachung dynamischer Auswirkungen in Know-down Experimenten und zeigt eine klare Überlegenheit aufgrund Echtzeit-Messungen gegenüber Endpunkt Analysen.
Das xCELLigence Real-time Cell Analyzer System wurde ursprünglich von der US-Firma ACEA Biosciences entwickelt, wird von Roche und ACEA gemeinschaftlich weiterentwickelt und wird von Roche weltweit exklusiv vermarktet. Das Design des elektronischen Sensors, innovative Technologien zur Datensammlung und Auswertung sowie optimale Bedienung machen dieses System zu einem einzigartigen Instrument für zellbasierte Assays mit Benchmark Potential in der zellularen und molekularen Biologie.
Weitere Informationen sind in Internet erhältlich: www.xcelligence.roche.com
(1) Jitao David Zhang, Angelika Duda, Christian Schmidt, Anja Irsigler, Stefan Wiemann, Ulrich Tschulena, Biochemica (2009).
In einer kürzlich durchgeführten Studie, analysierten Ulrich Tschulena et al vom Deutschen Krebsforschungszentrum, Abteilung Molekulare Genomanalyse, in Heidelberg die Auswirkungen des geringeren Levels von 160 humanen Kinasen auf das Zellwachstum in Echtzeit zu untersuchen. Die Wissenschaftler führten einen genetischen Loss-of-Function Screen mit einer Small Interfering RNA (siRNA) Library bestehend aus 160 Kinasen durch.
Um die Kinasen zu identifizieren, die einen Einfluss auf das Zellwachstum haben, untersuchten die Forscher eine siRNA Library, die aus Pools von vier siRNAs pro Gen der 160 getesteten humanen Kinasen mit einer Konzentration von 60nM bestehen. Bei der Analyse der Proben, die mit der siRNA Library transfiziert waren, zeigten 36 der insgesamt 160 siRNAs keinen signifikanten Effekte im Vergleich zu Placeboproben oder Negativkontrollen, die nicht mit siRNAs transfiziert wurden. Jedoch führte der Knock-down mehrerer Gene zu beträchtlichen Veränderungen in der Wachstumskurve. Wie erwartet, löste der Knockdown von mehr als der Hälfte der 160 getesteten Kinasen einen inhibitorischen Effekt auf das Zellwachstum aus. Im Gegensatz dazu erzeugt z.B. die siRNA EphA4 eine Zunahme des elektrischen Zellwiderstands im Vergleich zu den Negativkontrollen, die nicht mit siRNAs transfiziert wurden. Dies lässt auf einen Aktivierungseffekt bei der Zellproliferation schließen wenn die EphA4 Kinase nicht mehr vorhanden ist.
Die Experimente zeigen, dass das xCELLigence System eine einfache Methode ist, die Auswirkungen von Gen Knock-downs in Echtzeit zu analysieren: Das System bietet kontinuierlich eine große Menge an Informationen über den elektrischen Widerstand am Boden der Wells der Mikrotiterplatten. Zudem kann jede Veränderung hinsichtlich Zellanzahl, Zellmorphologie und Zellanhang in Echtzeit entdeckt werden. Das xCELLigence System kann gut kombiniert werden mit reverse-genetischen Screening-Experimenten die ein automatisiertes System wie die Biomek FXP Liquid Handling Workstation verwenden. Die Ergebnisse zeigen eine hohe Reproduzierbarkeit des Systems mit einem Variationskoeffizienten von unter 0,05. Darüber hinaus ist das System sehr nützlich in der Überwachung dynamischer Auswirkungen in Know-down Experimenten und zeigt eine klare Überlegenheit aufgrund Echtzeit-Messungen gegenüber Endpunkt Analysen.
Das xCELLigence Real-time Cell Analyzer System wurde ursprünglich von der US-Firma ACEA Biosciences entwickelt, wird von Roche und ACEA gemeinschaftlich weiterentwickelt und wird von Roche weltweit exklusiv vermarktet. Das Design des elektronischen Sensors, innovative Technologien zur Datensammlung und Auswertung sowie optimale Bedienung machen dieses System zu einem einzigartigen Instrument für zellbasierte Assays mit Benchmark Potential in der zellularen und molekularen Biologie.
Weitere Informationen sind in Internet erhältlich: www.xcelligence.roche.com
(1) Jitao David Zhang, Angelika Duda, Christian Schmidt, Anja Irsigler, Stefan Wiemann, Ulrich Tschulena, Biochemica (2009).
